La princesa Toadstool (Peach) ha sido secuestrada por el rey Koopa (Bowser) por primera vez y serán los hermanos Mario y Luigi quienes deberán recorrer el reino Champiñón para rescatarla. Deberás recorrer 8 mundos, cada uno con cuatro niveles. Ahora los niveles no se limitan al espacio de una pantalla, sino que la cámara seguirá a tu personaje mientras se mueve hacia la derecha hacia la meta del nivel.
La altura a la que salta tu personaje variará según el tiempo que tengas pulsado el botón de salto y podrás moverte en el aire, volviendo los controles de salto sean más precisos y haciendo parecer a los juegos anteriores donde apareció Mario toscos y torpes en comparación. Manteniendo pulsado el botón de correr tu personaje se moverá más rápido y esto también se traduce a que sus saltos serán más altos y llegarán más lejos. El salto también será tu principal modo de ataque, ya que derrotarás a los enemigos al caerles encima. A los goombas (los enemigos con forma de champiñón y cara de enfado) los aplastarás al caerles encima pero los koopas (las tortugas) se esconderán en su caparazón al pisarlos. Es entonces que tu personaje pateará al koopa al entrar en contacto con el para que su caparazón se deslice por el suelo, acabando con los enemigos que encuentre a su paso, pero el caparazón rebotará al chocar contra una pared y cambiará su dirección, pudiendo golpearte si no tienes cuidado. La meta de cada nivel está siempre en el extremo derecho de ésta y la cámara solo se moverá hacia la derecha siguiendo tu avance, no dejándote retroceder a las zonas del nivel que han sido dejado atrás por la cámara.
En los niveles habrá bloques con un signo de interrogación que soltará un objeto si los golpeas saltando desde abajo. La mayoría tendrán monedas, que también están repartidas por el nivel, y obtendrás una vida por cada cien que recolectes. Algunos bloques te darán una seta roja, que se moverá hacia la derecha y, al conseguirla, hará crecer el tamaño de tu personaje y le permitirá aguantar un golpe, tras lo cual volverá a su tamaño original. Cuando seas grande podrás destruir bloques de ladrillo golpeándolos desde abajo, lo que en ciertas ocasiones te permitirá abrirte hacia ciertas zonas del nivel, como una plataforma alta. Algunos bloques de ladrillo tendrán objetos que soltarán al golpearlos, pero no necesitas tener un tamaño grande para lograr que lo hagan. Cuando tengas el tamaño grande, los bloques que soltaban setas rojas ahora te darán flores de fuego, que, al obtenerlas, te permitirán lanzar bolas de fuego al pulsar el botón de correr y dichas bolas irán rebotando por el suelo y acabando con los enemigos que encuentren. También puedes encontrarte en algunos bloques con la estrella, la cual te hará invulnerable a los enemigos durante un instante, derrotándolos al tocarlos. Las setas verdes te darán una vida, pero estas setas suelen estar muy escondidas, estando algunas dentro de bloques invisibles que solo aparecerán si saltas al estar justo debajo.
Al final de cada mundo te encontrarás con un nivel del castillo del rey koopa, que suele estar infestado de fosos de lava y aspas giratorias de fuego. Al final de cada uno de estos niveles te esperará el rey koopa, quien empezaría a lanzarte su aliento de fuego incluso antes de aparecer en pantalla. La forma de vencerlo es atravesar el puente donde está, esquivándolo en el proceso, y agarrar el hacha que está detrás de él para destruir el puente y hacer que caiga a la lava que está debajo. Tras la batalla te esperará un toad que te indicará que tu princesa está en otro castillo. Este juego tiene un modo para que jueguen dos personas, pero éstas se irán turnando para jugar, controlando la primera a Mario y la segunda a su hermano Luigi.
Este juego fue probado usando el núcleo FCEUmm de Retroarch y funciona perfectamente.
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