Cuando Samus Aran aborda una fragata de piratas espaciales, se encuentra con Ridley, pirata con quien se había enfrentado en anteriores ocasiones. Samus sigue a Ridley a un planeta cercano, Talos IV, y allí descubrirá que la banda de piratas espaciales tiene instalaciones de investigación biológica en el planeta y que en dicho planeta se encuentran ruinas de la civilización chozo.
Para dar el salto al 3D, Metroid Prime ha optado por convertirse en un shooter en primera persona. Tienes tu disparo principal con munición infinita, tus misiles de munición limitada, puedes cargar el disparo principal, puedes tomar la forma de una esfera y en esa forma colocar bombas que, además de romper ciertos objetos y paredes, también te pueden impulsar hacia arriba para llegar a sitios altos en tu forma de esfera, aunque perderás casi todas esas habilidades al principio del juego y tendrás que encontrar por el mundo mejoras para tu armadura que te permitan usarlas de nuevo, junto a otras habilidades nuevas. También irás encontrando mejoras a tu capacidad máxima de salud y de munición. Puedes fijar la vista en un enemigo para no perderle de vista y puedes esquivar hacia los lados moviéndote y pulsando el botón de saltar. Puedes cambiar entre tu visor de combate y tu visor de escaneo, con el que podrás escanear cosas como las ruinas chozo y el equipo de investigación de la banda pirata para obtener más información sobre ellos, además de escanear a los enemigos para obtener información sobre su forma de atacar y sus puntos débiles. Además de estos dos visores encontrarás dos visores más, uno infrarojo y otro de rayos X.
El diseño de niveles no lineal de la saga Metroid se ha traducido en una red de salas y pasillos interconectados. Al igual que en los juegos anteriores en 2D, tendrás que ir encontrando mejoras para poder acceder a zonas nuevas del mapa. Hay puertas que se abren con misiles y otras para las que son necesarias que tengas una de las mejoras de tu arma principal en concreto. En este juego las mejoras de tu arma principal se consideran armas distintas entre las que podrás cambiar en cualquier momento durante el combate, aunque tu personaje tardará unos instantes en cambiar de un arma a otra. A ciertos enemigos solo les afectan cierto tipo de arma y podrás encontrar mejoras que te permitirán usar una poderosa arma mientras tengas un tipo de arma principal con el disparo cargado al pulsar el botón de disparar misiles, pero estas armas gastan una gran cantidad de misiles.
El objetivo final del juego es conseguir doce artefactos chozo y llevarlos a un cráter cercano al lugar de aterrizaje de tu nave. Para poder acceder a estos artefactos primero necesitarás conseguir las mejoras que te permitan acceder a todos los rincones del mapa. En el cráter de los artefactos encontrarás información de dónde y cómo obtener cada artefacto, necesitando para obtener algunos el realizar una acción muy específica. Una vez que consigas todos los artefactos y los lleves al cráter accederás a la recta final del juego y a su jefe final.
Este juego cuenta con textos en castellano.
Este juego ha sido probado en su versión de Wii contenida en Metroid Prime Trilogy en el emulador Dolphin. En el emulador puedes conectar por Bluetooth un mando de Wii, pero necesitarias colocar una barra de LEDs inalámbrica sobre tu pantalla. La mejor alternativa es configurar los controles para usar teclado y ratón, sustituyendo el apuntar con el mando de la Wii por los movimientos del ratón. Necesitarás aumentar la sensibilidad del apuntado en el menú opciones para poder apuntar hacia arriba.