A Shepard, comandante del ejército de la alianza humana, se le envía a recoger una baliza de origen proteano hallada en un yacimiento en la colonia humana de Eden Prime. La civilización proteana fue la que creó el sistema para los viajes espaciales, pero se extinguió hace 50000 años. La última vez que la humanidad había encontrado restos de la civilización proteana dio un salto tecnológico de 200 años. Cuando Shepard llega a Eden Prime, la colonia está bajo ataque de los Geth, una raza de androides con inteligencia artificial, comandado por Saren, agente de élite del gobierno galáctico renegado.
Este juego dispone de creador de personajes, el cual te permite elegir el sexo de Shepard y su aspecto. Podrás elegir entre seis clases para tu personaje, lo cual determinará que armas, armaduras y poderes podrá utilizar. Las armas disponibles son pistolas, fusiles de asalto, escopetas y fusiles de francotirador. Este juego combina mecánicas de juego de disparo con coberturas con elementos RPG, como poder mejorar tus estadísticas y poderes según se suba de nivel o ir adquiriendo armas y armaduras mejores según avance el juego.
Las especies que gobiernan el consejo galáctico son las asari, una raza formada exclusivamente por mujeres que se pueden reproducir con cualquier ser consciente de la galaxia, los turianos, reptiles humanoides que destacan por su poder militar, y los salarianos, anfibios con un rápido metabolismo que destacan en el ámbito científico. Fuera del consejo están la especie de los krogan, que fue infectada por una enfermedad creada por los salarianos y los turianos que hace que una ínfima parte de los bebés nazcan vivos. Esto fue una medida para contrarrestar el rápido crecimiento de la población krogan y neutrar la amenaza que la rebelión de esta especie suponía para el resto de especies. El pueblo quariano son una especie que vive en una flota nómada, ya que fueron expulsados de su planeta natal por los Geth, la raza de androides con inteligencia artificial que crearon. Al haberse habituado a vivir en un entorno estéril, necesitan llevar respiraderos fuera de sus naves para no contagiarse de enfermedades.
Shepard deberá seguir el rastro de Saren, que es desprovisto de su posición de agente de élite cuando se demuestra su traición. Se descubrirá que detrás de Saren hay un segador, perteneciente a una raza de máquinas inteligentes que se encargan de hacer desaparecer las civilizaciones galácticas cuando estas se vuelven demasiado avanzadas. Su objetivo es traer a la galaxia a los otros segadores para destruir las civilizaciones actuales, como hicieron con la proteana, y es tarea de Shepard impedirlo.
Según las opciones de diálogo que escojamos ganaremos puntos de virtud o rebeldía. Si tenemos suficientes puntos de uno o otro tipo podremos acceder a unas opciones de diálogo especiales. Algunas de estas opciones nos permitirá convencer a ciertos personajes para que cesen las hostilidades. Habrá momentos en que el juego nos hará tomar decisiones difíciles. Podremos importar el archivo de guardado en los siguientes juegos para que aparezcan reflejadas las consecuencias de dichas decisiones.
