Han pasado dos años desde que Banjo y Kazooie derrotarron a la bruja Gruntilda y ésta se ha pasado todo este tiempo enterrada debajo de una roca hasta que sus dos hermanas la rescataron, pero Gruntilda ha acabado convertida en un esqueleto. Gruntilda mata al topo Bottles cuando intentaba vengarse de Banjo y Kazooie y sus dos hermanas han construido una máquina para robar la energía vital de seres vivos para restaurar el cuerpo de Gruntilda.
Banjo y Kazooie conservan todos los movimientos que aprendieron en el juego anterior, mejorando la voltereta haciendo que se pueda girar mientras se realiza y sustituyendo el ataque de Banjo cuando está quieto y en el suelo por una serie de picotazos de Kazooie. Con Bottles muerto será su hermano JamJam el encargado de enseñar a Banjo y a Kazooie nuevos movimientos, pero esta vez necesitarás conseguir las notas musicales suficientes para poder aprender cada movimiento. En el primer nivel los nuevos movimientos serán agarrarse de los salientes, apuntar y disparar huevos desde la vista en primera persona y el usar a Kazooie como arma de fuego para las secciones de disparo en primera persona que tiene este juego. En estas secciones para girar hacia la izquierda y la derecha y moverse hacia delante y atrás se usa el stick analógico y para moverse hacia la derecha y izquierda y apuntar hacia arriba y hacia abajo se usan los botones C, lo que hace incómodo los controles cuando hay que apuntar hacia arriba, sobretodo si además hay que esquivar proyectiles enemigos. Kazooie aprenderá a usar nuevos tiupos de huevos: de fuego, granadas, de hielo y mecánicos, lo cuales liberarán a un pájaro mecánico que podrás controlar directamente, hacerlo pasar por pequeños huecos y hacerlo explotar pulsando un botón. Uno de los nuevos movimientos permitirá a Banjo y Kazooie separarse usando las plataformas de desdoblamiento. Podrás cambiar entre personajes en las plataformas de desdoblamiento o en ciertos puntos indicados con un brillo. Habrá botones que solo podrás pulsar cuando controles a solo uno de los dos y los dos personajes aprenderán habilidades que solo podrán usar en solitario. Serán los nuevos movimientos lo que te permitirá acceder a nuevas zonas de la isla de las brujas, el nivel que hace de nexo de los otros niveles. Será común que en ciertos niveles se requiera una habilidad que se aprende en un nivel posterior, así que habrá que volver a niveles anteriores con frecuencia.
Para ir abriendo los niveles habrá que ir al templo de Jigywiggy cuando hayas recolectado las suficientes piezas de puzzle que te pida para abrir el siguiente nivel y superar un desafío consistente en armar un puzzle, siendo la imagen del puzzle un vídeo en movimiento. En cada nivel hay diez piezas de puzzle y cinco jinjos a los que rescatar, siendo estos de varias familias cuyos miembros están desperdigados entre distintos niveles. Al rescatar a todos los miembros de una familia recibirás una pieza de puzzle. En cada nivel hay 100 notas musicales, pero están agrupadas en grupos de cinco, habiendo incluso claves de sol que valen por 20 notas. En cada nivel hay dos glowos, criaturas mágicas, que podrás entregarle a Humba Wumba para que te convierta en otra criatura con otras habilidades o a Mumbo Jumbo para poder controlarlo en ese nivel. El fin de controlar a Mumbo es llevarlo a las plataformas con su cara para que use su magia, siendo su efecto distinto en cada nivel. Debido a que los niveles son más grandes que en el juego anterior se han añadido a los niveles plataformas de teletransporte, que se irán desbloqueando al entrar en contacto con ellas.
Además de por el nivel que hace de nexo, los niveles están interconectados por otros caminos e incluso tienen estaciones de tren. Para viajar entre estaciones de tren primero deberás restaurar el tren y pedirle amablemente a su conductor permiso para usarlo y luego tendrás que buscar en los niveles el interruptor que abre la estación de dicho nivel para poder viajar hacia ella usando el tren. Habrá zonas de ciertos niveles a la que solo podrás acceder en tren y habrá personajes a los que deberás transportar en tren de un nivel a otro. También deberás usar la interconexión entre niveles para poder conseguir ciertas piezas de puzzles, teniendo que realizar diversas acciones en distintos niveles.
Este juego dispone de textos en castellano.
Este juego ha sido probado usando el núcleo Mugen64Plus-Next de Retroarch y, salvo un error gráfico respecto a la sombra del personaje que es ligeramente molesto durante las cinemáticas, funciona perfectamente.
