El ejército de Bowser ha atacado siete reinos y sus sirvientes Koopalings les han robado sus varitas a los reyes de esos reinos y las han usado para transformarlos en animales. La princesa Peach manda a Mario y Luigi para que se enfrenten a las fuerzas de Bowser y salven a los reyes. Cuando, por fin, Mario y Luigi terminan con su misión, Bowser secuestrará a Peach por tercera vez y nuestros héroes deberán enfrentarse a él para rescatarla.

Tu personaje tendrá en este juego la habilidad de agarrar a las tortugas cuando estén escondidas en su caparazón para lanzarlas donde más te convenga, pudiendo saltar mientras cargas con ellas. Habrá bloques especiales que no podrás golpear saltando desde abajo al estar en el suelo, así que tendrás que lanzarles un caparazón para que suelten sus objetos. Pero tendrás que tener cuidado, ya que las tortugas saldrán de su caparazón con el tiempo, causando daño a tu personaje, aunque habrá una animación que te avisará cuando estén a punto de salir. También hay bloques en ciertos niveles que podrás agarrar y lanzar y éstos no rebotarán y te golpearán como pueden hacer los caparazones. Al correr se llenará una barra y, según lo llena que esté, hará que tu personaje salte más alto y más lejos. Correr en línea recta la llenará mientras que saltar, dejar de correr y cambiar de dirección la vaciará. La mayor parte de los niveles consisten en ir hacia la derecha, donde estará la meta, pero hay algunos donde habrá que entrar por puertas y tuberías a distintas partes del nivel, llegando algunos a ser bastante laberínticos. En algunos niveles la pantalla se moverá automáticamente hacia la derecha y tendrás que moverte por el nivel a su ritmo, no pudiendo atravesar los bordes laterales de la pantalla.

Al igual que en el Super Mario Bros. original, saldrán setas de ciertos bloques al golpearlos que te harán más grande y te permitirán aguantar un golpe antes de morir. Pero se han incluido más power-ups además de la flor de fuego que podrás conseguir mientras estés en tu forma grande. El power-up que saldrá de un bloque depende de éste. El más destaclable entre los nuevos es la hoja que te da cola de tanuki. Con la cola podrás golpear enemigos y romper bloques, lo que es útil para los bloques que no puedas golpear desde abajo sin tener que lanzarles un caparazón. Cuando estés en el aire podrás pulsar repetidamente el botón de salto para que tu personaje descienda más despacio. Cuando la barra de correr esté llena, al saltar podrás volar durante un rato, pudiendo elevarte a una altura considerable para encontrar zonas secretas en los niveles, incluso hay alguno en el que necesitas conseguir el power-up y usarlo para encontrar la meta del nivel. Para que fuera técnicamente posible que tu personaje volara era necesario hacer que la pantalla se moviera en diagonal mientras seguía a tu personaje, cosa que la NES no podía hacer debido a sus limitaciones. Para sortear esas limitaciones se incluyó en el cartucho del juego el chip MMC3. Puede que la posibilidad de incluir este chip fuese uno de los motivos por lo que se decidió sacar el juego en formato cartucho originalmente en Japón en lugar de sacar el juego para la Famicom Disk System, como hizo Nintendo los juegos que desarrolló desde la salida del periférico, ya que en un disquete no se puede añadir chips para añadir funcionalidades a la consola. Pero el cartucho no incluía una pila interna para poder guardar la partida aun si el juego era más largo y complejo que sus antecesores, no pudiendo guardar la partida hasta los lanzamientos del juego en consolas posteriores, como la SNES o la Gameboy Advance. Y ni siquiera tenía un sistema de contraseñas para compensar.

Ahora los niveles no se suceden uno detrás de otro, sino que tendrás un mapa de cada mundo donde podrás elegir el nivel al que vas a entrar, teniendo cada mundo una temática diferente. Deberás completar un nivel para abrir el camino en el mapa, pero habrá veces en la que haya varios caminos cada uno con un nivel, por lo que no es necesario completar todos los niveles para avanzar en el juego. En medio de los mapas te encontrarás con fortalezas enemigas. Estos niveles, repletos de fosos de lava, tienen al final un jefe al que le tendrás que saltar encima tres veces, evitando caerle encima cuando se agache y se proteja con los pinchos de su caparazón. Este jefe es el mismo en todos las fortalezas, pero se irá moviendo más rápido y se le agregará la habilidad de volar con tal de que la batalla sea más difícil. En estos niveles también encontrarás a los Boos, fantasmas que se quedarán quietos si los miras y te perseguirán si miras para otro lado, haciendo su debut en este juego. Además de niveles en el mapa hay casas que te darán a elegir a ciegas entre tres power-ups. Estos power-ups los tendrás guardados para usarlos en el mapa cuando veas que es conveniente usar uno para enfrentarte a algún nivel. En el mapa habrá enemigos que se irán moviendo cada vez que entres a un nivel y puede que en ocasiones te obstaculicen el paso. Caundo entras en contacto con ellos en el mapa tendrás un enfrentamiento. Al vencerlos te darán un power-up para que lo uses en el mapa.

Al final del mapa estará el castillo del rey. Cuando entres, tu personaje se subirá al barco volador del Koopaling que le ha robado la varita al rey. En este nivel la pantalla se moverá automáticamente hacia la derecha y hacia arriba y abajo mientras un montón de cañones disparan sin cesar. Al final del barco volador habrá una tubería que te llevará dentro del barco, donde tendrás un enfrentamiento contra el Koopaling. Tendrás que saltarle a la cabeza tres veces mientras usa la varita para dispararte proyectiles. Una vez vencido, recuperará la varita, devolverás su verdadera forma al rey y aparecerás en el siguiente mundo.

Este juego ha sido probado con el núcleo FCEUmm de Retroarch y funciona perfectamente.