King K. Rool ha llegado a la isla Kong con una terrible arma de destrucción masiva en busca de venganza. Para distraer a Donkey Kong, le ha robado los plátanos dorados y ha secuestrado a Diddy, Tiny, Lankly y Chunky Kong. En este colect-a-thon podrás controlar a cinco personajes diferentes, cada uno con habilidades únicas, teniendo que utilizar los barriles de cambio de personaje colocados en ciertas partes de los niveles para controlar a otro personaje, pero primero deberás rescatarlo de su prisión situada en uno de los niveles. Cada coleccionable solo podrá ser recogido por un personaje concreto, utilizando el juego colores para indicar que personaje puede recoger cada objeto. Al solo poder cambiar de personaje en puntos del nivel muy concretos se vuelve algo tedioso tener que volver al barrir de cambio de personaje cada vez que encuentres un coleccionable de otro personaje. En cada nivel hay 100 plátanos normales y 5 dorados para cada personaje. Para abrir la puerta del jefe del nivel necesitarás recolectar el suficiente número de plátanos normales, teniendo que enfrentarte a él con un personaje en concreto. Para desbloquear el siguiente nivel necesitarás tanto vencer al jefe del nivel anterior como haber conseguido el número suficiente de plátanos dorados.
Las habilidades básicas de cada personaje son realizar un salto simple, agacharse, dar un salto alto al saltar mientras se agacha, un salto de longitud al saltar mientras corre y se agacha, un ataque mientras no se mueven, un ataque mientras avanzan hacia delante y un ataque en salto. Cada personaje realizará estos ataques de forma distinta, pudiendo variar su alcance. Tus personajes también podrán trepar por árboles, saltar de liana en liana y lanzar granadas, aunque dispondrás de un número limitado de éstas. En los niveles podrás encontrar monedas que solo pueden recoger ciertos personajes y que sirven para comprar ciertas mejoras y movimientos. En el laboratorio de Cranky podrás cambiarlas por una poción que dará un nuevo movimiento al personaje. Algunos de estos movimientos solo podrán ser usados en plataformas con la cara del personaje y otros solo en barriles con su cara. Éstos últimos consumirán cristales de coco mientras se usen, estando estos cristales repartidos por los niveles. También podrás comprarle a Funky Kong un arma a distancia para cada personaje. Estas armas tienen munición limitada y no solo sirven para atacar a los enemigos, sino que también pueden activar interruptores, siendo cada interruptor específico de cada personaje. Y, por último, podrás comprar en la tienda de música un instrumento para cada uno de tus personajes. Al tocar un instrumento causará daños a los enemigos cercanos, pero tiene usos limitados que se pueden recargar al tocar unos auriculares que encontrarás en ciertas partes de los niveles. Hay plataformas con el dibujo de uno de los instrumentos que tocan uno de tus personajes que, al tocar dicho instrumento mientras estás encima, activará un mecanismo.
Para conseguir algunos de los plátanos dorados tendrás que superar minijuegos que se encuentran repartidos por los niveles, habiendo variaciones del mismo minijuego con distinta dificultad. En cada nivel hay cinco enemigos que portan parte de los planos del arma de King K. Rool. Llevando estos planos a Snide obtendrás un plátano dorado a cambio, además que podrás ver la parte del plano que has reunido. El número de partes del plano que hayas conseguido determinará el tiempo que tengas para desactivar el arma de King K. Rool en una sección al final del juego. Justo después de esta sección encontrarás una puerta que no te dejará avanzar a menos que hayas conseguido cuatro coronas. Estas coronas se obtienen al vencer en las arenas de combate que encontrarás en los niveles. El objetivo de estas arenas es aguantar durante un tiempo mientras enemigos no paran de aparecer, evitando la derrota o caer fuera de la arena. En los niveles también habrá hadas que deberás capturar usando una cámara de fotos. Al capturar estas hadas aumentará el número de cristales de coco máximos que podrás cargar.
Dentro de Donkey Kong 64 podrás encontrarte con los juegos Donkey Kong y Jetpac. El primero está en forma de máquina recreativa en uno de los niveles y, la primera vez que lo completes, obtendrás un plátano dorado. La segunda vez conseguirás una moneda de Nintendo 64. Al segundo juego podrás jugar si le enseñas a Cranky que has conseguido 15 medallas de plátano, las cuales recibes cada vez que uno de tus personajes ha conseguido 75 plátanos en un nivel. Al conseguir en Jetpac una cierta cantidad de puntos aparecerá en el juego una moneda de Rare que podrás recoger. Tanto la moneda de Nintendo 64 como la de Rare son necesarias para poder acceder a la batalla contra el jefe final.
Este juego cuenta con textos y voces en inglés.
Este juego ha sido probado usando el núcleo Muplen64Plus-Next de Retroarch y funciona perfectamente.