A Shepard, comandante del ejército de la alianza humana, se le envía a recoger una baliza de origen proteano hallada en un yacimiento en la colonia humana de Eden Prime. La civilización proteana fue la que creó el sistema para los viajes espaciales, pero se extinguió hace 50000 años. La última vez que la humanidad había encontrado restos de la civilización proteana dio un salto tecnológico de 200 años. Cuando Shepard llega a Eden Prime, la colonia está bajo ataque de los Geth, una raza de androides con inteligencia artificial, comandado por Saren, agente de élite del gobierno galáctico renegado.
Las especies que gobiernan el consejo galáctico son las asari, una raza formada exclusivamente por mujeres que se pueden reproducir con cualquier ser consciente de la galaxia, los turianos, reptiles humanoides que destacan por su poder militar, y los salarianos, anfibios con un rápido metabolismo que destacan en el ámbito científico. Fuera del consejo están la especie de los krogan, que fue infectada por una enfermedad creada por los salarianos y los turianos que hace que una ínfima parte de los bebés nazcan vivos. Esto fue una medida para contrarrestar el rápido crecimiento de la población krogan y neutrar la amenaza que la rebelión de esta especie suponía para el resto de especies. El pueblo quariano son una especie que vive en una flota nómada, ya que fueron expulsados de su planeta natal por los Geth, la raza de androides con inteligencia artificial que crearon. Al haberse habituado a vivir en un entorno estéril, necesitan llevar respiraderos fuera de sus naves para no contagiarse de enfermedades.
Shepard deberá seguir el rastro de Saren, que es desprovisto de su posición de agente de élite cuando se demuestra su traición. Se descubrirá que detrás de Saren hay un segador, perteneciente a una raza de máquinas inteligentes que se encargan de hacer desaparecer las civilizaciones galácticas cuando estas se vuelven demasiado avanzadas. Su objetivo es traer a la galaxia a los otros segadores para destruir las civilizaciones actuales, como hicieron con la proteana, y es tarea de Shepard impedirlo.
Este juego dispone de creador de personajes, el cual te permite elegir el sexo de Shepard y su aspecto. Podrás elegir entre seis clases para tu personaje, lo cual determinará que armas, armaduras y poderes podrá utilizar. Las armas disponibles son pistolas, fusiles de asalto, escopetas y fusiles de francotirador. Este juego combina mecánicas de juego de disparo con coberturas con elementos RPG, como poder mejorar tus estadísticas y poderes según se suba de nivel o ir adquiriendo armas y armaduras mejores según avance el juego.
Controlarás directamente a Shepard y te acompañarán dos personajes para apoyarte durante el combate. Podrás usar los cuatro tipo de armas, pero serán los puntos que hayas invertido en sus habilidades correspondientes los que determinarán la efectividad de éstas, siendo inútil que uses armas con las que tu personaje no tenga entrenamiento. Las armas no tendrán munición pero se recalentarán, teniendo que esperar unos instantes a que se enfríen del todo antes de poder volver a dispararlas si la barra de sobrecalentamiento del arma llega al máximo. Tanto tus personajes como algunos enemigos tendréis escudos que absorverán los disparos y evitarán que vuestras barras de salud bajen. La barra de escudo se recargará cuando el personaje pase unos instantes sin sufrir daño y eso es así tanto para tus personajes como los enemigos. Contigo llevarás unas unidades de medigel, que podrás usar para restaurar la salud de tus tres personajes, pero hay un máximo que podrás llevar que aumentará si compras mejoras de capacidad de medigel. También portarás granadas y podrás equiparte con mejoras que les darán un efecto a tus granadas. También podrás equiparles mejoras a tu arma y un tipo especial de munición que causará daño a un tipo concreto de enemigo.
Ademas de tus armas puedes usar poderes para combatir al enemigo. Estos poderes dependen de la clase de tu personaje y se pueden ir mejorando en el menú de habilidades con los puntos que obtienes al subir de nivel al igual que tu destreza con las armas. Al usar uno de tus poderes deberás esperar un instante a que se recargue para volver a usarlo. El tiempo de recarga de cada nivel depende de cada poder. También podrás ordenar a los dos personajes que te acompañan que usen uno de sus poderes en el enemigo al que apuntes. Algunos de estos poderes son sobrecarga, que causa gran daño en los escudos y en enemigos mecánicos, pirateo, que hace que los enemigos con inteligencia sintética ataquen a los otros enemigos, siendo estos poderes propios de las clases con dominio tecnológico. Las clases bióticas, especializadas en usar el efecto masa en el combate, tienen poderes como lanzamiento, que empujará y derribará a distancia a los enemigos, alzamiento, que los elevará en el aire, y barrera, que usará los poderes bióticos para aumentar la barra de escudos durante un instante. También hay poderes asociados a las armas que se obtendrán al gastar los suficientes puntos en la habilidad de dicha arma. Hay algunas habilidades, tanto de poderes como destreza con el arma, que estarán bloqueadas al principio y deberás alcanzar el nivel suficiente en otra habilidad para desbloquearla.
Según las opciones de diálogo que escojamos ganaremos puntos de virtud o rebeldía. Hay una habilidad cuyo nivel máximo al que puedes subirla está determinado por los puntos de virtud que tengas y otra con lo que pasa lo mismo, pero con puntos de rebeldía. Estas habilidades nos ofrecerán ciertas opciones de diálogo adicionales. Algunas de estas opciones nos permitirá convencer a ciertos personajes para que cesen las hostilidades. Habrá momentos en que el juego nos hará tomar decisiones difíciles. Podremos importar el archivo de guardado en los siguientes juegos para que aparezcan reflejadas las consecuencias de dichas decisiones.
